做座出入境木包装松材线虫检疫创新技术的研究下

出入境木包装松材线虫检疫创新技术的研究(下)

4、雄虫端生交合伞观察技术

就伞滑刃线虫雄虫来说，其端生交合伞的形状，在鉴定上具有重要意义。正常情况下，雄虫杀死后侧面观呈“J”形，观察到的尾部呈鸡爪状，很难观察到端生交合伞的实际形状。端生交合伞卵园形还是平截状，是确定松材线虫还是拟松材线虫鉴别特保证在液压管线意外爆裂时能安全自锁征之一。在检疫工作的实践中，我们摸索出两种雄虫端生交合伞的简易观察方法。 4.1盖玻片推移法。

在解剖镜下，挑取加热杀死后呈“J”形的线虫或直接将新鲜的雄虫置于载玻片水滴里，一条即可。用挑针将载玻片上的雄虫尽可能放在水滴的中央底部，水滴要小，以免加盖玻片时线虫飘移到盖玻片的外缘。用吸水纸吸去盖玻片四周多余的水份。加盖玻片时，应先将盖玻片放在水滴的一边，用挑针托住盖玻片的另一边，轻轻放下，接近水滴时，将挑针突然向外下方抽去，将载玻片移至显微镜下，用低倍镜找到线虫，调到40倍或就在低倍镜下，一边观察一边用竹挑针粗端轻轻挤压盖玻片，或用竹挑针轻轻推移盖玻片，直至雄虫的尾端背面或腹面朝上为止。这时将显微镜调至高倍就可以清楚地观察到雄虫端生交合伞的形状。在实验室里，我们常用两食指来做这一工作更为简单有效。将雄虫在解剖镜目镜20X，物镜0.X状况下，调好焦距，将两食指分别放在盖玻片的两侧，轻轻推移盖玻片，或稍加用力推盖玻片，此时若端生交合伞仍不展开，则需用吸水纸吸去盖玻片中多余的水份，再用两食指推移盖玻片，就能将雄虫端生交合伞展开。此时将载坡片移到显微镜高倍镜下，就能观察到交合伞的形状。在制做线虫临时水玻片时可同时进行上述工作。先进行线虫其它形态特征观察，最后如需要再进行推移法观察雄虫尾端特征。用TAF固定液或FP4:1固定液固定的线虫同样能用此法展开雄虫端生交合伞。

4.2拉直法。

将样品中分离到的线虫，加热杀死后，置于解剖镜下，挑取 1条雄虫，置于载玻片的水滴中，水滴要小。将载玻片移至解剖镜下，用竹挑针将雄虫向水滴的外缘拨动，接近边缘时，用竹挑针挑住雄虫的头部，将线虫轻轻拖出水滴的外缘，这时线虫已呈直线状，尾端自然背面在上，虫体尾部不再是鸡爪状。这时将载玻片移至显微镜下，低倍镜找到线虫，高倍镜下就可以观察到雄虫端生交合伞的形状。此法存有一个缺点，线虫拖出水滴后，由于光源的热幅射作用，线虫四周的水份很快蒸发，动作慢时虫体内的水份也蒸发掉，如果这时仍在移动线虫，就会造成虫体断裂。虫体失去水份后，变形，失去鉴定意义，导致观察失败。考虑到水份迅速蒸发的情况，改用稀甘油、乳酚油或FP4:1固定液代替水的方法，效果较好，但要处理好竹挑针和虫体之间的粘附作用。

我们在实际操作时，以第一种方法应用为多，因为它能在显微镜下较长时间观察，并能制成半永久玻片，掌握要领，成功率百分之百。

5、雌雄线虫快速培养技术

由于进境木包装所处的环境条件恶劣，分离所获取的松材线虫往往量比较少，这少量的松材线虫又往往是持续型或繁殖型幼虫，幼虫可供鉴别的特征不多，并常与一些其它类型的线虫相混淆，因此，幼虫不作为松材线虫鉴定的依据。需用培养的方法，使幼虫长成成虫。按照常规采用单异活体培养的方法进行线虫的繁殖，包括培养基的制做，真菌的接种繁殖，以及线虫的接已有超过5000人表示种。最起码需要十多天，才能获得繁殖的线虫。少量的线虫接种能否成活还是一个问题。除非用于研究，这种方法在实际工作中一般不采用。由于持续型幼虫属于一种抗逆性的虫态，如果改变线虫所处的环境条件，使其正常生长，就能获得松材线虫的雌雄成虫。基于上述原理，我们在工作中采用下述方法来获取松材线虫的成虫。将发现幼虫的样本重新制样，样本处理成长约10厘米，样本横截面长宽1×1厘米的小木条多根，一端浸在水中，水深至1/3处，放入250C保温保湿培养箱中分离培养线虫，每隔一天分离一次线虫，2天后在水中能够获得所需的成虫。同样，将同一样本，适量喷水，外套牛皮纸再用塑料袋扎紧，放入培养箱中，天后分离线虫也能获得雌雄成虫。这种方法是利用样本本身的营养，通过环境条件的改变，促使线虫恢复正常的生长发育。

6、样本中活线虫的保存技术

进境木包装松材线虫检验检疫，涉及到贸易合同的执行。因此结果的可重复性非常重要。在工作中我们注意到，如果粗放地保存严重破坏镜头样品，往往几个星期后就不能重复检验检疫结果，这对外贸工作非常不利。由于松材线虫林间调查工作，对留存样品的工作研究较少，缺乏系统、现成的技术。针对上述情况，我们对几种留存方法经过比较试验后发现：自然室温存放的样品（夏季），二个月后基本上分离不到线虫；样品保存在冰箱保鲜层，二个月后样本中线虫量与初期线虫量几乎没有差别；样品存放在25避免有害气体、灰尘和油雾0℃保温培养箱中，一个月左右线虫量有所增加，但随后量却有所下降。从上面的试验中不难看出，样品存放的方式以保鲜存放比较适合。从试验中我们也发现，将有线虫的木包装通过太阳的爆晒和一定时间的存放，不失为一种经济适用的杀死木包装中有害线虫的简易方法。

作者/周 弘连云港出入境检验检疫局